雞源雙抗平臺NKCE的親和力、表位覆蓋范圍及功能活性評估
本文來源于微信公眾： 生物制藥小編 作者： wothman
T細胞接合器（TCE）一直是雙抗領域中繞不開的一座大山。
在這種類型的雙特異性抗體中，其中一端特異性通過其表面的CD3受體招募T細胞，另一端特異性通過腫瘤相關受體如EpCAM、CD19、CD20、BCMA、GPRC5D或DLL3結合癌細胞上的腫瘤相關抗原，從而實現(xiàn)將免疫細胞直接動員至腫瘤部位，在那里它們激活免疫細胞介導的抗腫瘤免疫反應，同時不傷害健康細胞。
自從2014年以來，TCE已經(jīng)在血液腫瘤中獲得了驚人的成功，雖然有效，但是安全和劑量限制毒性問題不可忽視。尤其是細胞因子釋放綜合征（CRS）常常會限制TCE雙抗的使用。
與T細胞不同，NK細胞無需預先致敏即可快速識別并摧毀異常細胞，且副作用相對溫和。采用NK細胞作為NK細胞接合器（NKCE）的策略已有多家Biotech企業(yè)嘗試開發(fā)中。
最近OmniAb公司就在mAbs發(fā)布了該公司的NKCE平臺技術，不過讓人意想不到的是，這個技術平臺以“雞”這種動物的抗體作為技術核心之一。
通用輕鏈和雞鼠平臺
開發(fā)雙特異性抗體面臨一個主要技術難題：輕鏈錯配。一個典型的抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。在實驗室中同時生產(chǎn)兩種不同的抗體“半成品”（分別針對A靶點和B靶點）時，它們的重鏈和輕鏈很容易隨機組合，產(chǎn)生四種組合，由于目標只有一種，那么就產(chǎn)生了大量非目標產(chǎn)物，嚴重影響純度和產(chǎn)量。
因此，科學界常常采用“共同輕鏈”（cmLC）技術，指的是靶向不同targets的不同抗體中所使用的輕鏈是一致的。這樣，在組裝針對不同靶點的抗體時，就完全避免了輕鏈的混亂配對，使得大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量的雙特異性抗體成為可能。
2017年獲批的血友病藥物emicizumab（Hemlibra®）就是首款成功的cmLC雙抗。不過要如何快速篩選出這種cmLC雙抗呢？
研究團隊采用兩個互補的動物平臺，它們都能產(chǎn)生全人源序列的cmLC抗體。
OmniClic™ 和 OmniFlic®。它們都基于“通用輕鏈”（cmLC）技術，能產(chǎn)生完全人源序列的抗體，但宿主動物截然不同——前者使用基因工程改造的雞，后者則使用大鼠。
哺乳動物（包括人類和大鼠）通過V（D）J重組機制產(chǎn)生抗體多樣性，即從多個基因片段中隨機拼接出不同的重鏈和輕鏈。
而雞則采用一種名為“基因轉換”（gene conversion）的獨特機制：它們只有一個功能性重鏈V基因，但通過高頻替換其可變區(qū)，從一系列偽基因中拷貝小片段DNA來對其進行修飾和多樣化，也能生成高度多樣化的抗體庫。
這種進化上的“另類路徑”，使得雞對人類抗原可能產(chǎn)生與哺乳動物完全不同的識別方式，從而挖掘出全新的抗體表位。而大鼠等哺乳動物與人類更近緣，它們的免疫系統(tǒng)可能覺得NKp46似曾相識，從而跳過某些表位，限制了抗體表位多樣性。研究假設：聯(lián)合使用Clic和Flic平臺，可以獲得比任何單一平臺更全面、互補的抗體庫。
研究團隊以NK細胞上的重要激活器NKp46為模型靶點開展實驗。他們分別用NKp46蛋白免疫OmniClic雞和OmniFlic大鼠，隨后從單個B細胞中分離出特異性抗體，并對其親和力、表位覆蓋范圍及功能活性進行全面評估。
雞鼠互補
研究的核心突破在于對表位多樣性的深度解析。表位是抗原上被抗體識別的具體區(qū)域，不同表位的抗體可能觸發(fā)不同的生物學效應。擁有針對多個不同表位的抗體，對于設計最優(yōu)化的療法至關重要。
團隊采用高通量表面等離子共振（SPR）技術，對119個抗體克隆進行了“表位分箱”（epitope binning）分析——即測試任意兩個抗體是否能同時結合NKp46，若不能，則說明它們識別的是重疊或鄰近的表位。
研究結果顯示：OmniFlic大鼠平臺成功重現(xiàn)了文獻中已知的四個經(jīng)典NKp46抗體（Innate-1至4）所對應的全部四個表位群；
而OmniClic雞平臺雖僅重現(xiàn)其中一個（Innate-2），卻發(fā)現(xiàn)了六個全新、鼠類平臺無法產(chǎn)生的獨特表位群，這證明了研究人員最初的假設，即使用雞源平臺能夠提供一個完全不同的視角來更好找到新表位；
兩個平臺共識別出14個不同的表位社區(qū)（communities），其中僅有2個為共享，其余均為各自獨有。
隨后，研究人員還利用氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）這項技術通過測量蛋白質(zhì)主鏈氫原子與溶液中氘原子的交換速率，定位抗體結合后受保護的區(qū)域。
結果驗證了SPR分箱結果的可靠性。如Com-4C1能結合L39-F62區(qū)域，與Innate-4基準重疊。Com-3（如dAb D01）可結合H108-F121，位于蛋白遠端的獨特口袋。Com-2a以L135-Y147為核心，但成員間有細微差異。最引人注目的是C08——一個Clic抗體，擁有從未見過的獨特表位（Com-2U），直接與Innate-1基準競爭，這表明它結合了一個關鍵的功能區(qū)域。
ADCC實戰(zhàn)檢驗
研究人員將三個代表性抗體（分別來自雞和鼠的不同表位群）改造為EGFR/NKp46雙特異性抗體，采用Morrison格式（2+2四價結構，兩個NKp46臂和兩個EGFR臂）。這種四聚體結構像分子交聯(lián)劑，強制NK細胞與腫瘤細胞親密接觸。利用經(jīng)典的A549肺癌細胞系和人源NK細胞進行抗體依賴性細胞毒性（ADCC）實驗。
他們測試了兩種配置：將EGFR臂連接在NKp46抗體的重鏈或輕鏈末端，并使用活性Fc（結合CD16a）或“沉默”Fc。
他們發(fā)現(xiàn)了以下三種規(guī)律：
①所有測試的雙抗均能在無Fc效應功能（即沉默F(xiàn)c，排除CD16a通路干擾）的情況下介導腫瘤殺傷，證明單純激活NKp46就足以觸發(fā)NK細胞殺傷活性。
②活性Fc未增效，最佳表現(xiàn)者反而是Flic來源的F15的沉默F(xiàn)c輕鏈連接版本，顯著優(yōu)于活性Fc版本，甚至超過西妥昔單抗對照。
③輕鏈大于重鏈，將EGFR-scFv連接在抗體輕鏈末端（LC-tethered）的格式，比連接在重鏈末端（HC-tethered）更有效。
傳統(tǒng)上，科學家通常認為激活FcγRIIIa（CD16a）能增強ADCC。但在此系統(tǒng)中，同時激活NKp46和CD16a反而可能因空間位阻或信號干擾而降低效率。
這表明，在設計NKCE時，還需要考慮分子幾何結構與價態(tài)問題，并非激活越多就越好。
總結
總的來說，這項研究證明了OmniClic平臺可以作為嚙齒類系統(tǒng)的可行替代，同時也說明了NKCE開發(fā)的復雜挑戰(zhàn)，還有更多的基礎研究有待開發(fā)，期望未來NKCE相關平臺能有更好發(fā)展。
