Hawk蛋白相互作用功能定量分析平臺(tái)助力提升 NSCLC 免疫治療療效

近年來(lái)，以 PD-1/PD-L1 抑制劑為代表的免疫治療已成為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）治療的主要方案，顯著改善了部分患者的預(yù)后。然而，臨床數(shù)據(jù)顯示，約 60% 的 NSCLC 患者對(duì)這類免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療無(wú)響應(yīng)，即便 PD-L1 表達(dá)水平達(dá)標(biāo)的患者，也存在較高的治療抵抗率。

當(dāng)前臨床采用的 PD-L1 表達(dá)（腫瘤比例評(píng)分 TPS）作為預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物，存在明顯局限性：既無(wú)法精準(zhǔn)識(shí)別治療獲益的真正患者，也難以避免無(wú)效治療帶來(lái)的醫(yī)療資源浪費(fèi)、免疫相關(guān)不良風(fēng)險(xiǎn)和高額經(jīng)濟(jì)壓力。因此，開發(fā)更可靠、更精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)指標(biāo)，優(yōu)化患者分層策略，成為提升 NSCLC 免疫治療療效的關(guān)鍵需求。  
1、研究隊(duì)列與樣本收集
* 納入188 例接受 PD-1/PD-L1 抑制劑治療（單藥或聯(lián)合化療）的 NSCLC 患者，樣本來(lái)自西班牙、法國(guó)、荷蘭多中心醫(yī)院及生物樣本庫(kù)。
* 收集患者腫瘤組織的福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本，同時(shí)整理臨床數(shù)據(jù)（性別、年齡、治療線數(shù)、活檢部位等）。
* 對(duì) 135 例患者樣本進(jìn)行 PD-L1 表達(dá)評(píng)分（TPS），分為高表達(dá)（≥50%）和低表達(dá)（<50%）。
 
2、核心技術(shù)：用QF-Pro 平臺(tái)檢測(cè) PD-1/PD-L1 功能結(jié)合狀態(tài)
這是本研究的核心技術(shù)，QF-Pro是由 HAWK Biosystems公司自主研發(fā)的蛋白相互作用功能定量分析平臺(tái)�；�于共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）與熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）技術(shù)，可精準(zhǔn)量化細(xì)胞間 PD-1/PD-L1 的實(shí)際結(jié)合水平。具體流程如下：
* 樣本處理：取患者FFPE樣本的 3 張連續(xù)切片，1 張用于 HE 染色（病理醫(yī)生識(shí)別腫瘤靶區(qū)），另外 2 張分別標(biāo)記為 “供體單獨(dú)組” 和 “供體 - 受體組”。
* 抗體標(biāo)記：采用兩種特異性單克隆抗體，分別識(shí)別 PD-1 和 PD-L1；PD-1 抗體偶聯(lián)供體發(fā)色團(tuán) ATTO488，PD-L1 抗體偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶（HRP），再通過(guò)酪酰胺信號(hào)放大技術(shù)將受體發(fā)色團(tuán) Alexa-594 標(biāo)記至 HRP。
* 信號(hào)檢測(cè)：使用 488nm 調(diào)制激光激發(fā)供體，通過(guò)CMOS 探測(cè)器記錄供體熒光壽命；當(dāng) PD-1 與 PD-L1 結(jié)合（距離 1-10nm）時(shí)，供體熒光壽命縮短，通過(guò)該變化量化結(jié)合效率（FRET 效率）。
* 數(shù)據(jù)采集：對(duì)病理醫(yī)生標(biāo)注的腫瘤區(qū)域，采集所有感興趣區(qū)域（ROI）數(shù)據(jù)；無(wú)明確標(biāo)注時(shí)，至少分析 50 個(gè) ROI 或整個(gè)組織，以規(guī)避腫瘤異質(zhì)性影響。
 
3. 統(tǒng)計(jì)分析
* 采用 Shapiro-Wilks 檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)正態(tài)性驗(yàn)證。
* 運(yùn)用 Cox 回歸分析評(píng)估各因素（PD-1/PD-L1 結(jié)合狀態(tài)、PD-L1 表達(dá)、性別、年齡等）對(duì)總生存期（OS）的影響。
* 使用 Cutoff Finder 工具確定 FRET 效率臨界值，將患者分為高結(jié)合組（前 40%）和低結(jié)合組（后 60%），通過(guò) log-rank 檢驗(yàn)比較兩組生存差異。  
研究結(jié)論
1、PD-1/PD-L1 功能結(jié)合狀態(tài)與 PD-L1 表達(dá)無(wú)相關(guān)性：研究證實(shí)，PD-L1 TPS 評(píng)分與 PD-1/PD-L1 實(shí)際結(jié)合效率（FRET 值）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)（r=0.05，P=0.55），說(shuō)明單純的 PD-L1 表達(dá)水平無(wú)法反映其與 PD-1 的功能結(jié)合狀態(tài)。
2、功能結(jié)合狀態(tài)是免疫治療響應(yīng)的強(qiáng)效預(yù)測(cè)指標(biāo)：高 PD-1/PD-L1 結(jié)合效率的患者，OS 和無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）顯著更長(zhǎng)，即135 例患者隊(duì)列中，高結(jié)合組中位 OS 達(dá) 31 個(gè)月，低結(jié)合組僅 10 個(gè)月（P<0.0001）；中位 PFS 分別為 17 個(gè)月和 7 個(gè)月（P<0.0001），而 PD-L1 高 / 低表達(dá)組的 OS、PFS 無(wú)顯著差異。
3、優(yōu)化患者分層，擴(kuò)大獲益人群：24% 的患者雖 PD-L1 低表達(dá)，但 PD-1/PD-L1 高結(jié)合，這類患者對(duì)免疫治療響應(yīng)良好；同時(shí)可排除 PD-L1 高表達(dá)但結(jié)合水平低的無(wú)效治療人群，減少副作用風(fēng)險(xiǎn)。
4、一線治療優(yōu)勢(shì)顯著：高結(jié)合狀態(tài)患者接受一線免疫治療時(shí)，獲益更突出，即中位 OS 超 50個(gè)月，遠(yuǎn)高于二線治療的 18個(gè)月，提示應(yīng)優(yōu)先為這類患者安排一線免疫治療。

該研究說(shuō)明QF-Pro技術(shù)作為一種研究蛋白質(zhì)功能的新技術(shù)，在科研和臨床診斷中都具有顯著價(jià)值。同時(shí)，也明確 PD-1/PD-L1 功能結(jié)合狀態(tài)可以作為 NSCLC 免疫治療的精準(zhǔn)預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物，為臨床實(shí)現(xiàn) “精準(zhǔn)篩選、個(gè)體化治療” 提供了全新解決方案，有望大幅提升免疫治療的響應(yīng)率與臨床獲益。
 
原文鏈接：https://doi.org/10.1200/JCO.22.01748
 
HAWK Biosystems是一家源自西班牙的創(chuàng)新型生物科技企業(yè)，聚焦空間功能蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，其核心技術(shù) QF-Pro® 平臺(tái)基于 FRET/FLIM（熒光共振能量轉(zhuǎn)移 / 熒光壽命成像顯微鏡）原理， 具有超高分辨率、高特異性與靈敏度。

該系統(tǒng)以雙抗體雙位點(diǎn)捕獲目標(biāo)蛋白，以 10 nm 分辨率原位量化功能蛋白的空間圖譜，精準(zhǔn)量化組織中蛋白質(zhì)的相互作用與功能狀態(tài)，突破了傳統(tǒng)技術(shù)僅能檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)的局限。適用于如石蠟包埋的切片、固定的組織切片、固定的孔板內(nèi)細(xì)胞等；廣泛用于蛋白-蛋白相互作用，蛋白翻譯后修飾，免疫治療有效性評(píng)估、腫瘤微環(huán)境信號(hào)解析、藥物靶點(diǎn)原位驗(yàn)證等方向。   
環(huán)亞生物與 HAWK 的合作關(guān)系
環(huán)亞生物科技有限公司（APG BIO）已正式成為 HAWK Biosystems 在中國(guó)地區(qū)的獨(dú)家代理商，全權(quán)負(fù)責(zé) HAWK 核心技術(shù)與產(chǎn)品的全鏈條事務(wù)。作為深耕中國(guó)生命科學(xué)領(lǐng)域的專業(yè)服務(wù)商，環(huán)亞生物將依托自身成熟的技術(shù)支持體系與市場(chǎng)網(wǎng)絡(luò)，為國(guó)內(nèi)研究者提供 QF-Pro® 空間蛋白質(zhì)定量分析平臺(tái)的推廣、銷售、應(yīng)用培訓(xùn)及售后保障等一站式服務(wù)。

環(huán)亞產(chǎn)品
環(huán)亞生物科技有限公司（APG BIO Ltd）成立于2011年，專注于引進(jìn)國(guó)外創(chuàng)新技術(shù)和高品質(zhì)儀器設(shè)備。
 
主推產(chǎn)品包括
美國(guó)Sage Science全自動(dòng)脈沖場(chǎng)核酸片段回收系統(tǒng)，用于測(cè)序樣本文庫(kù)優(yōu)化
德國(guó)InnoMe活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像系統(tǒng)，用于活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像分析
英國(guó)ArrayJet超高通量生物芯片點(diǎn)樣儀，用于高通量篩選
美國(guó)Plexarray超高通量SPRi分子互作儀
西班牙Hawk高精度原位蛋白定量分析系統(tǒng)，便于高精度蛋白分析
E-Peak 毛細(xì)管電泳質(zhì)控儀
E-Pro4 全自動(dòng)蛋白質(zhì)凝膠電泳和成像分析儀 
E-Tracking 微孔板加樣記錄儀，實(shí)時(shí)追蹤孔板加樣
Blotcycler全自動(dòng)蛋白質(zhì)免疫印跡雜交儀等產(chǎn)品
 
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