可視化細(xì)胞代謝新方案：比例熒光生物傳感器的自動(dòng)成像與分析
引言
在探索活細(xì)胞代謝的科研工作中，使用基因編碼的熒光生物傳感器幫助科學(xué)家觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵代謝物的實(shí)時(shí)變化，不斷革新著我們對(duì)細(xì)胞內(nèi)部動(dòng)態(tài)的理解，為疾病機(jī)制解析開(kāi)辟了新路徑；此外，熒光生物傳感器還展現(xiàn)出了高通量、高內(nèi)涵藥物篩選的巨大應(yīng)用潛力，在藥物研發(fā)過(guò)程中，幫助研究者更快地找關(guān)鍵靶點(diǎn)，加速新藥的研發(fā)進(jìn)程，為患者帶來(lái)福音。今天和大家分享一套解決方案，該方案通過(guò) Agilent BioTek Cytation 成像平臺(tái)以高通量方式利用基因編碼的生物傳感器進(jìn)行活細(xì)胞研究。
NAD+/NADH 熒光生物傳感器
NAD+/NADH 在多個(gè)細(xì)胞區(qū)室中扮演眾多角色，其中最重要的功能與線(xiàn)粒體能量產(chǎn)生相關(guān)，它們通過(guò)相互轉(zhuǎn)化來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的有氧和無(wú)氧代謝過(guò)程。NAD+ 接受電子和氫離子形成還原型 NADH，這一過(guò)程是 ATP 生成的關(guān)鍵步驟。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種能夠在活細(xì)胞水平檢 NAD+/NADH 的熒光生物傳感器，比如 SoNar、Peredox 和 iNap 等工具，本案例中采用的 Peredox 傳感器將綠色熒光蛋白的亮度與 NADH 的相對(duì)豐度耦合在一起，因此隨著 NAD+/NADH 增加，Peredox 的綠色強(qiáng)度也會(huì)增加；此外，Peredox 設(shè)計(jì)還包括第二個(gè)穩(wěn)定的 mCherry 熒光蛋白作為參考信號(hào)，這樣綠光與紅光發(fā)射強(qiáng)度的比值使得 Peredox 報(bào)告信號(hào)獨(dú)立于傳感器表達(dá)水平。與強(qiáng)度設(shè)計(jì)相比，比率生物傳感器在定量分析方面具有優(yōu)勢(shì)，因此，本案例中涉及的自動(dòng)化策略同樣適應(yīng)其他比例生物傳感器的使用，例如 FRET 傳感器，SoNar 傳感器等。
基于圖像的生物傳感器的高通量檢測(cè)流程
由于 NAD+/NADH 比率型熒光生物傳感器的設(shè)計(jì)特點(diǎn)通常包括兩種熒光蛋白，能夠提供穩(wěn)定而明亮的細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)，非常適合于基于圖像的高通量檢測(cè)，一般來(lái)說(shuō)，需要檢測(cè)設(shè)備具有多通道、多孔位的自動(dòng)化圖像采集及圖像分析能力，安捷倫的 Cytation&Gen5 自動(dòng)化圖像處理平臺(tái)能夠?yàn)榇祟?lèi)比率熒光生物傳感器提供優(yōu)異的檢測(cè)性能，主要工作流程如圖 1 所示：包括生物傳感器細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、細(xì)胞接種及藥物處理?xiàng)l件優(yōu)化、Cytation 自動(dòng)化成像平臺(tái)圖像采集、Gen5 軟件熒光信號(hào)單細(xì)胞分析、藥物劑量響應(yīng)曲線(xiàn)擬合和結(jié)果輸出等環(huán)節(jié)。
細(xì)胞內(nèi) NAD+/NADH 的可視化檢測(cè)
Peredox-mCherry-NLS 生物傳感器在活體 MCF10A 細(xì)胞中可視化狀態(tài)如圖 2 所示。當(dāng) Peredox 傳感器與 NAD+ 結(jié)合時(shí)，綠色熒光信號(hào)較暗，而當(dāng) Peredox 與 NADH 結(jié)合時(shí)，綠色熒光信號(hào)較亮。因此，熒光色通道中 Peredox 的強(qiáng)度表示 NAD+/NADH 比率，同時(shí)用 mCherry 的紅色熒光信號(hào)做傳感器總量的標(biāo)準(zhǔn)化處理。
通過(guò)在培養(yǎng)基中添加特定比例的超生理濃度（10 mM）乳酸和丙酮酸，能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi) NAD+/NADH 的比例，此方法已經(jīng)被驗(yàn)證能夠有效將綠紅熒光比的變化轉(zhuǎn)換為胞質(zhì) NAD+/NADH 的比率。圖 2 的上一行圖像中，細(xì)胞處于 NAD+/NADH 低的培養(yǎng)基條件，而圖像的下一行展示了細(xì)胞內(nèi)高 NAD+/NADH 的培養(yǎng)基條件。
在生理?xiàng)l件下，胞質(zhì)糖酵解速率是影響 NAD+/NADH 比率的主要因素。葡萄糖通過(guò)糖酵解生成丙酮酸、ATP 和 NADH。在 MCF10A 細(xì)胞中，Peredox 傳感器的高綠/紅熒光比通常指示高糖酵解活性；而低熒光比則表明糖酵解活性較低。
生物傳感器作用效果的自動(dòng)化圖像分析流程
我們此案例使用 Agilent BioTek Cytation 5 多模式細(xì)胞成像系統(tǒng)和 Gen5 軟件，對(duì) Peredox 熒光生物傳感器進(jìn)行自動(dòng)圖像分析和定量，如圖 3 所示。
Step1：
為了保證單細(xì)胞分析的準(zhǔn)確度，需要使用Cytation 的 20X 以上的物鏡捕獲綠色和紅色發(fā)射通道圖像，并在 Gen5 軟件中自動(dòng)進(jìn)行細(xì)胞識(shí)別分割（黃色輪廓）。
Step2：
計(jì)算并繪制每個(gè)孔中所有已識(shí)別的細(xì)胞核的絕對(duì)綠/紅強(qiáng)度比值，軟件可繪制圖像水平的頻率-柱狀圖。
Step3：
在多孔板矩陣視圖中顯示 96 孔微孔板中每個(gè)孔的絕對(duì)綠/紅強(qiáng)度比平均值，輸出孔水平的可視化色彩梯度圖像。
Step4：
Gen5 軟件可使用低傳感器狀態(tài)的孔的結(jié)果作為對(duì)照值，將絕對(duì)綠紅強(qiáng)度比執(zhí)行自動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化操作，從而提供整個(gè)板上的標(biāo)準(zhǔn)化傳感器信號(hào)比。
Step5：
軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)化的 8 點(diǎn)校準(zhǔn)曲線(xiàn)，自動(dòng)計(jì)算EC50 值（紅色虛線(xiàn)），對(duì)應(yīng)的 Kr 值約為 100。最后，Gen5 軟件將使用校準(zhǔn)曲線(xiàn)和實(shí)驗(yàn)樣品孔的標(biāo)準(zhǔn)化綠紅比率自動(dòng)量化 NAD+/NADH 比率，以上結(jié)果與 Peredox-mCherry 已公布的響應(yīng)特征非常一致。
方案優(yōu)勢(shì)及拓展
通過(guò)本文介紹的比例熒光生物傳感器的自動(dòng)成像與分析方案，能夠定量細(xì)胞內(nèi)的 NAD+/NADH 比率，研究者可以評(píng)估藥物處理是否顯著改變了細(xì)胞的代謝反應(yīng)，用于建立自動(dòng)化藥物及篩選方案，通過(guò) Cytation5 的單一平臺(tái)，能夠建立標(biāo)準(zhǔn)方案，通過(guò)方案調(diào)用檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)評(píng)價(jià)流程的標(biāo)準(zhǔn)化操作，減少人為因素的干擾，極大節(jié)約人力物力成本。
除此之外，一些研究需要更定量的方法，并希望將標(biāo)準(zhǔn)化傳感器比率轉(zhuǎn)換為分析物水平（例如胞質(zhì) NAD+/NADH 比率），此類(lèi)校準(zhǔn)有些情況可以在活細(xì)胞中進(jìn)行，對(duì)于 Peredox，可以使用已建立的方法在活細(xì)胞的整個(gè)響應(yīng)范圍內(nèi)進(jìn)行信號(hào)校準(zhǔn)，以精確評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi) NAD+/NADH 比率，Cytation5 可搭載適用于活細(xì)胞檢測(cè)的氣體控制系統(tǒng)，用于此類(lèi)方案的開(kāi)發(fā)。
最后，在活細(xì)胞能量的代謝領(lǐng)域，安捷倫還能夠提供 Seahorse XF 活細(xì)胞能量代謝分析儀，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的氧消耗率（OCR）和細(xì)胞外酸化率（ECAR），能夠同時(shí)分析活細(xì)胞中的糖酵解和線(xiàn)粒體功能。而 Cytation5 平臺(tái)和 Seahorse XF 系統(tǒng)聯(lián)合使用，可以實(shí)現(xiàn)從代謝活性到細(xì)胞形態(tài)、功能的全面分析。感興趣的讀者，歡迎隨時(shí)和我們聯(lián)系獲取更多應(yīng)用方案。
在探索活細(xì)胞代謝的科研工作中，使用基因編碼的熒光生物傳感器幫助科學(xué)家觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵代謝物的實(shí)時(shí)變化，不斷革新著我們對(duì)細(xì)胞內(nèi)部動(dòng)態(tài)的理解，為疾病機(jī)制解析開(kāi)辟了新路徑；此外，熒光生物傳感器還展現(xiàn)出了高通量、高內(nèi)涵藥物篩選的巨大應(yīng)用潛力，在藥物研發(fā)過(guò)程中，幫助研究者更快地找關(guān)鍵靶點(diǎn)，加速新藥的研發(fā)進(jìn)程，為患者帶來(lái)福音。今天和大家分享一套解決方案，該方案通過(guò) Agilent BioTek Cytation 成像平臺(tái)以高通量方式利用基因編碼的生物傳感器進(jìn)行活細(xì)胞研究。
NAD+/NADH 熒光生物傳感器
NAD+/NADH 在多個(gè)細(xì)胞區(qū)室中扮演眾多角色，其中最重要的功能與線(xiàn)粒體能量產(chǎn)生相關(guān)，它們通過(guò)相互轉(zhuǎn)化來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的有氧和無(wú)氧代謝過(guò)程。NAD+ 接受電子和氫離子形成還原型 NADH，這一過(guò)程是 ATP 生成的關(guān)鍵步驟。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種能夠在活細(xì)胞水平檢 NAD+/NADH 的熒光生物傳感器，比如 SoNar、Peredox 和 iNap 等工具，本案例中采用的 Peredox 傳感器將綠色熒光蛋白的亮度與 NADH 的相對(duì)豐度耦合在一起，因此隨著 NAD+/NADH 增加，Peredox 的綠色強(qiáng)度也會(huì)增加；此外，Peredox 設(shè)計(jì)還包括第二個(gè)穩(wěn)定的 mCherry 熒光蛋白作為參考信號(hào)，這樣綠光與紅光發(fā)射強(qiáng)度的比值使得 Peredox 報(bào)告信號(hào)獨(dú)立于傳感器表達(dá)水平。與強(qiáng)度設(shè)計(jì)相比，比率生物傳感器在定量分析方面具有優(yōu)勢(shì)，因此，本案例中涉及的自動(dòng)化策略同樣適應(yīng)其他比例生物傳感器的使用，例如 FRET 傳感器，SoNar 傳感器等。
基于圖像的生物傳感器的高通量檢測(cè)流程
由于 NAD+/NADH 比率型熒光生物傳感器的設(shè)計(jì)特點(diǎn)通常包括兩種熒光蛋白，能夠提供穩(wěn)定而明亮的細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)，非常適合于基于圖像的高通量檢測(cè)，一般來(lái)說(shuō)，需要檢測(cè)設(shè)備具有多通道、多孔位的自動(dòng)化圖像采集及圖像分析能力，安捷倫的 Cytation&Gen5 自動(dòng)化圖像處理平臺(tái)能夠?yàn)榇祟?lèi)比率熒光生物傳感器提供優(yōu)異的檢測(cè)性能，主要工作流程如圖 1 所示：包括生物傳感器細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、細(xì)胞接種及藥物處理?xiàng)l件優(yōu)化、Cytation 自動(dòng)化成像平臺(tái)圖像采集、Gen5 軟件熒光信號(hào)單細(xì)胞分析、藥物劑量響應(yīng)曲線(xiàn)擬合和結(jié)果輸出等環(huán)節(jié)。
圖 1：活細(xì)胞熒光生物傳感器的多通道高通量圖像分析工作流程
細(xì)胞內(nèi) NAD+/NADH 的可視化檢測(cè)
Peredox-mCherry-NLS 生物傳感器在活體 MCF10A 細(xì)胞中可視化狀態(tài)如圖 2 所示。當(dāng) Peredox 傳感器與 NAD+ 結(jié)合時(shí)，綠色熒光信號(hào)較暗，而當(dāng) Peredox 與 NADH 結(jié)合時(shí)，綠色熒光信號(hào)較亮。因此，熒光色通道中 Peredox 的強(qiáng)度表示 NAD+/NADH 比率，同時(shí)用 mCherry 的紅色熒光信號(hào)做傳感器總量的標(biāo)準(zhǔn)化處理。
圖2：生物傳感器多通道成像和傳感器可視化狀態(tài)示意圖
通過(guò)在培養(yǎng)基中添加特定比例的超生理濃度（10 mM）乳酸和丙酮酸，能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi) NAD+/NADH 的比例，此方法已經(jīng)被驗(yàn)證能夠有效將綠紅熒光比的變化轉(zhuǎn)換為胞質(zhì) NAD+/NADH 的比率。圖 2 的上一行圖像中，細(xì)胞處于 NAD+/NADH 低的培養(yǎng)基條件，而圖像的下一行展示了細(xì)胞內(nèi)高 NAD+/NADH 的培養(yǎng)基條件。
在生理?xiàng)l件下，胞質(zhì)糖酵解速率是影響 NAD+/NADH 比率的主要因素。葡萄糖通過(guò)糖酵解生成丙酮酸、ATP 和 NADH。在 MCF10A 細(xì)胞中，Peredox 傳感器的高綠/紅熒光比通常指示高糖酵解活性；而低熒光比則表明糖酵解活性較低。
生物傳感器作用效果的自動(dòng)化圖像分析流程
我們此案例使用 Agilent BioTek Cytation 5 多模式細(xì)胞成像系統(tǒng)和 Gen5 軟件，對(duì) Peredox 熒光生物傳感器進(jìn)行自動(dòng)圖像分析和定量，如圖 3 所示。
Step1：
為了保證單細(xì)胞分析的準(zhǔn)確度，需要使用Cytation 的 20X 以上的物鏡捕獲綠色和紅色發(fā)射通道圖像，并在 Gen5 軟件中自動(dòng)進(jìn)行細(xì)胞識(shí)別分割（黃色輪廓）。
Step2：
計(jì)算并繪制每個(gè)孔中所有已識(shí)別的細(xì)胞核的絕對(duì)綠/紅強(qiáng)度比值，軟件可繪制圖像水平的頻率-柱狀圖。
Step3：
在多孔板矩陣視圖中顯示 96 孔微孔板中每個(gè)孔的絕對(duì)綠/紅強(qiáng)度比平均值，輸出孔水平的可視化色彩梯度圖像。
Step4：
Gen5 軟件可使用低傳感器狀態(tài)的孔的結(jié)果作為對(duì)照值，將絕對(duì)綠紅強(qiáng)度比執(zhí)行自動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化操作，從而提供整個(gè)板上的標(biāo)準(zhǔn)化傳感器信號(hào)比。
Step5：
軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)化的 8 點(diǎn)校準(zhǔn)曲線(xiàn)，自動(dòng)計(jì)算EC50 值（紅色虛線(xiàn)），對(duì)應(yīng)的 Kr 值約為 100。最后，Gen5 軟件將使用校準(zhǔn)曲線(xiàn)和實(shí)驗(yàn)樣品孔的標(biāo)準(zhǔn)化綠紅比率自動(dòng)量化 NAD+/NADH 比率，以上結(jié)果與 Peredox-mCherry 已公布的響應(yīng)特征非常一致。
圖 3：使用安捷倫 Cytation5 和 Gen5 圖像分析軟件開(kāi)展生物傳感器作用效果的自動(dòng)化圖像分析流程
方案優(yōu)勢(shì)及拓展
通過(guò)本文介紹的比例熒光生物傳感器的自動(dòng)成像與分析方案，能夠定量細(xì)胞內(nèi)的 NAD+/NADH 比率，研究者可以評(píng)估藥物處理是否顯著改變了細(xì)胞的代謝反應(yīng)，用于建立自動(dòng)化藥物及篩選方案，通過(guò) Cytation5 的單一平臺(tái)，能夠建立標(biāo)準(zhǔn)方案，通過(guò)方案調(diào)用檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)評(píng)價(jià)流程的標(biāo)準(zhǔn)化操作，減少人為因素的干擾，極大節(jié)約人力物力成本。
除此之外，一些研究需要更定量的方法，并希望將標(biāo)準(zhǔn)化傳感器比率轉(zhuǎn)換為分析物水平（例如胞質(zhì) NAD+/NADH 比率），此類(lèi)校準(zhǔn)有些情況可以在活細(xì)胞中進(jìn)行，對(duì)于 Peredox，可以使用已建立的方法在活細(xì)胞的整個(gè)響應(yīng)范圍內(nèi)進(jìn)行信號(hào)校準(zhǔn)，以精確評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi) NAD+/NADH 比率，Cytation5 可搭載適用于活細(xì)胞檢測(cè)的氣體控制系統(tǒng)，用于此類(lèi)方案的開(kāi)發(fā)。
最后，在活細(xì)胞能量的代謝領(lǐng)域，安捷倫還能夠提供 Seahorse XF 活細(xì)胞能量代謝分析儀，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的氧消耗率（OCR）和細(xì)胞外酸化率（ECAR），能夠同時(shí)分析活細(xì)胞中的糖酵解和線(xiàn)粒體功能。而 Cytation5 平臺(tái)和 Seahorse XF 系統(tǒng)聯(lián)合使用，可以實(shí)現(xiàn)從代謝活性到細(xì)胞形態(tài)、功能的全面分析。感興趣的讀者，歡迎隨時(shí)和我們聯(lián)系獲取更多應(yīng)用方案。
SeahorseXF 分析儀與 Cytation 多模式平臺(tái)聯(lián)合應(yīng)用
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關(guān)于安捷倫細(xì)胞分析
安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)包括xCELLigence RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測(cè)儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測(cè)和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測(cè)與分析方案開(kāi)發(fā)。
安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)包括xCELLigence RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測(cè)儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測(cè)和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測(cè)與分析方案開(kāi)發(fā)。
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