核酸擴增法中LOD的可靠性取決于支原體菌株質量的原因

本文核心要點速覽：

1. 死菌DNA會導致支原體核酸檢測的LOD虛假偏低
2. 菌株的GC/CFU比值是評估其質量的核心指標
3. 方法驗證必須使用經過標定的菌株

在基于核酸擴增技術（NAT）的支原體檢測中，檢測限（LOD）常被視作方法靈敏度的核心指標。然而，在實際的方法學驗證與應用中，一個常被忽視的問題是：

LOD的可靠性首先取決于支原體菌株的質量。

支原體檢測qPCR擴增

01 NAT檢測的本質：檢測支原體核酸
與培養(yǎng)法不同，NAT方法直接檢測支原體DNA信號，這意味著：
✦ NAT無法區(qū)分活菌與死菌
✦ 檢測結果高度依賴樣品中的基因拷貝數(shù)（GC）
 

dPCR檢測支原體GC

對于支原體菌株，行業(yè)通用的生物學定量單位是菌落形成單位（CFU），關鍵在于，GC與CFU之間并不存在恒定比例關系。
 

 
支原體固體平皿培養(yǎng)

02 GC/CFU比值：影響LOD的關鍵但隱蔽因素
在支原體菌株制備過程中，常面臨以下挑戰(zhàn)：

支原體液體培養(yǎng)

• 支原體易聚集，難以均勻分散。
• 不同種類支原體培養(yǎng)條件差異大，工藝復雜。
• 支原體個體微小，不易直接觀察計數(shù)。
• 培養(yǎng)過程中容易產生死菌。
• 死菌會釋放游離DNA，顯著抬高GC含量。

當GC/CFU比值過高時：

• LOD在數(shù)據(jù)上看似更低。
• 實際檢測信號可能主要來源于死菌核酸。
• 對于核酸檢測而言，高濃度的檢測對于檢測體系要求反而更低。
• 導致核酸法靈敏度被“虛假放大”。

03 行業(yè)共識：并非所有菌株都適合用于LOD驗證
當前行業(yè)普遍認同：

• ATCC提供的標準支原體菌株在一致性和可追溯性方面更具優(yōu)勢。
• 多數(shù)合格菌株的GC/CFU比通�？刂圃�10以下（除非另有說明）。
• 應選擇適用于NAT方法LOD驗證和方法學確認的菌株。

EP 2.6.7草案（Pharmeuropa 36.1）對于菌株的要求：

• 支原體應在生長的指數(shù)階段收獲，以保證菌株活性。
• 應在凍存工作懸浮液/稀釋液之前測定CFU。
• CFU的測定應進行一定數(shù)量的重復。
• 對于基因組拷貝數(shù)(GC)的測定，必須同時考慮上清和細胞這兩種組分。
• 確定GC/CFU比值的接受標準：除非另有說明，否則參考品的GC/CFU比值應小于10。