垂直輪生物反應器系統(tǒng)助力iPSC衍生胰島全流程3D懸浮分化

摘要
本研究利用垂直輪生物反應器，成功將iPSC有效分化為功能性胰島（SC-islets）。這些胰島在細胞組成、代謝功能和轉(zhuǎn)錄成熟度上與成人供體胰島相似，且在葡萄糖刺激下能有效分泌胰島素。單細胞分析顯示無異質(zhì)性，移植后小鼠血糖穩(wěn)態(tài)恢復，移植物功能成熟。該技術有助于規(guī)模化生產(chǎn)臨床級別的胰島，為糖尿病治療提供新途徑。
  PART 01 研究背景
糖尿病是一種全球性健康問題，影響著數(shù)億人的生活。傳統(tǒng)的治療方法，如胰島素注射和生活方式調(diào)整，雖然能夠控制血糖水平，但無法根治糖尿病。干細胞療法，尤其是從多能干細胞中分化出的胰島，為糖尿病的治療提供了新的思路。這些胰島能夠模擬人體內(nèi)的胰島功能，有望恢復患者的胰島素分泌能力。

PART 02 研究方法
研究團隊采用了垂直輪生物反應器系統(tǒng)，這是一種高度可控和動態(tài)的細胞培養(yǎng)環(huán)境，能夠促進細胞的生長和定向分化。該系統(tǒng)通過準確控制氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)水平、pH值和機械刺激等參數(shù)，模擬胰腺的動態(tài)和異質(zhì)性微環(huán)境，從而促進細胞的分化和成熟。

研究中使用的人類誘導多能干細胞（iPSCs）來源于健康供體的外周血單個核細胞（PBMCs）。這些iPSCs在PBS垂直輪生物反應器中進行擴增，并在反應器中通過六個階段分化方案（S1至S6）分化為胰島。每個階段都通過特定的生長因子和抑制劑進行調(diào)控，以確保細胞的有效分化。（詳細方案見原文章：Complete Suspension Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Pancreatic Islets Using Vertical Wheel? Bioreactors。doi.org/10.1101/2023.08.09.552676）

PART 03 實驗結(jié)果
01 人iPSC可在垂直輪式生物反應器中定向分化均一的SC-胰島細胞簇
在0.5L垂直輪生物反應器中，iPSCs的擴增達到了9.971億個細胞，平均簇大小為250微米。通過完整的懸浮分化方案，iPSCs在垂直輪生物反應器中有效分化為胰島，最終產(chǎn)量達到了1.35億個SC-islet細胞。
 
圖3. SC-胰腺祖細胞中細胞異質(zhì)性的單細胞viSNE和降維可視化

a. 實驗設計概覽，用于對S4細胞進行單細胞質(zhì)量流式細胞術和細胞異質(zhì)性的降維分析。
b.第4階段50,000個祖細胞的單細胞viSNE圖，顯示PDX1、NKX6.1和CHGA標記物，與未分化的iPSC對照細胞對比。顏色梯度表示viSNE島嶼中細胞密度，從高（紅色）到低（藍色）。
c. S4細胞簇的免疫組化圖像。比例尺為50微米。
d. S4胰腺祖細胞的流式細胞術的降維可視化（FlowSOM），針對NKX6.1、PDX1、GP2和CHGA，與供體原代胰島細胞和未分化的iPSC對照細胞對比。顏色梯度表示內(nèi)分泌譜系軌跡中細胞密度，從高（紅色）到低（藍色）。
e. S4細胞中PDX1、NKX6.1和CHGA的單細胞分辨率的自組織星形圖。 自組織圖的最小生成樹顯示基于蛋白表達水平的樣本無監(jiān)督聚類（右側(cè)）。熱圖比例尺顯示細胞簇中每個蛋白標記的表達水平（左側(cè)）。
 
圖4. SC-胰島細胞中細胞異質(zhì)性的單細胞viSNE和降維可視化

a. 實驗設計概覽，用于對SC-胰島細胞進行單細胞質(zhì)量流式細胞術和細胞異質(zhì)性的降維分析。
b. 單細胞viSNE圖顯示了50,000個S6w1細胞在NKX6.1、CHGA以及胰島激素INS、GCG和SST的表達情況，并與初級供體胰島細胞和未分化的iPSC對照細胞進行了比較。顏色漸變表示viSNE島嶼中細胞的密度，從高密度（紅色）到低密度（藍色）。
c. S6w1簇的免疫組織化學染色。標尺，50 μm。
d. S6w1島嶼中CPEP、NKX6.1和ISL1的viSNE表示及定量分析，與iPSC對照組進行比較。顏色漸變表示viSNE島嶼中細胞的密度，從高密度（紅色）到低密度（藍色）。
e. S6w1細胞CPEP和NKX6.1的流式細胞術維度縮減可視化（FlowSOM），與供體初級胰島細胞和未分化的iPSC對照細胞進行比較。顏色漸變表示內(nèi)分泌譜系軌跡中細胞的密度，從高密度（紅色）到低密度（藍色）。
f. 單細胞分辨率下的自組織星形圖，顯示CPEP和NKX6.1標記物。自組織映射的最小生成樹展示了基于蛋白質(zhì)表達水平的樣本無監(jiān)督聚類（右）。熱圖尺度顯示了每個蛋白標記在細胞簇中的表達（左）。

04 懸浮培養(yǎng)的SC-胰島在體外實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組學上的成熟
通過TaqMan低密度基因陣列（TLDA）卡進行的內(nèi)分泌轉(zhuǎn)錄組分析顯示，SC-islets的轉(zhuǎn)錄組與成人供體胰島相似，表明SC-islets在轉(zhuǎn)錄水平上已經(jīng)成熟。
 
圖5. 干細胞衍生胰島的轉(zhuǎn)錄成熟
a. 熱圖展示SC-胰島與原代胰島及未分化iPSCs相比的胰島分化基因簇。
b. 實時表達分析，顯示從iPSCs分化至S6階段過程中上調(diào)的選定基因。
c. 火山圖展示SC-胰島與未分化iPSCs對比，以顯示體外上調(diào)和下調(diào)的關鍵基因集。
d. 關鍵胰島特異性基因集隨分化階段進展上調(diào)的氣泡圖（左側(cè)）。熱圖顏色比例尺（右上角）顯示基因表達水平，氣泡大小指標（右下角）代表分化各階段每種轉(zhuǎn)錄本的密度。
e. 循環(huán)聚類熱圖展示從階段0、1、3、4、5和6與原代供體胰島相比，所有與胰腺分化相關的基因的平均表達水平，每個階段n=2。熱圖比例尺顯示基因表達水平（>0表示上調(diào)，<0表示下調(diào)）。
f. 小提琴圖展示S6w1細胞的SC-胰島與成人人類胰島及未成熟S6w0細胞相比的成熟β細胞特征。
g. 小提琴圖展示S6w1細胞從起源時間起與成熟β細胞標志性過程相關的基因表達水平。

05 懸浮培養(yǎng)的SC-胰島具備功能性胰島素分泌機制
SC-islets在靜態(tài)和動態(tài)葡萄糖響應性胰島素釋放實驗中顯示出成熟的胰島素分泌能力。在高葡萄糖（16.7 mM）和KCl去極化條件下，S6w1胰島顯示出明顯的胰島素分泌增加。
 
圖6. 干細胞衍生胰島的功能表型
a. 對11 mM（G11）、2.8 mM（G3）、16.7 mM（G17）葡萄糖、10 ng/ml艾塞那肽（EX4）和35 mM KCl的動態(tài)灌流的胰島素分泌反應。分泌追蹤結(jié)果根據(jù)總DNA含量進行標準化（n=3），來自兩個獨立分化批次復制的五十個S6w1簇。
b. S6w1簇在靜態(tài)孵育中對不同葡萄糖濃度從G3到G17和KCl的胰島素分泌反應與成人供體胰島相比。結(jié)果根據(jù)每個用于釋放實驗的胰島進行標準化，n=5。成人供體胰島的技術復制平均分泌，n=2。
c. 熱圖展示S6w1細胞與未成熟S6w0細胞相比，與成熟β細胞標志性過程、葡萄糖代謝和功能相關的基因表達譜。
d-e. 小提琴圖展示負責胰島素分泌、氧化磷酸化、糖酵解和TCA循環(huán)途徑的基因的平均表達。

06 人胰腺祖細胞與 SC-胰島移植后可有效逆轉(zhuǎn)小鼠高血糖癥
將S4和S6w1細胞移植到鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病免疫缺陷SCID beige小鼠的腎包膜下，結(jié)果顯示S6w1移植小鼠在移植后42天內(nèi)血糖水平迅速下降，并在105天內(nèi)穩(wěn)定控制血糖，明顯優(yōu)于S4細胞。
  圖7. 干細胞衍生的胰腺祖細胞和胰島簇的體內(nèi)移植
a. 實驗概覽和時間線，展示在小鼠中移植后3-4個月對S4和S6細胞的移植物評估。
b. 移植前SC-S4/S6細胞組成的代表性流式細胞術確認。
c. 移植后3個月，從S4w0和S6w1移植小鼠中收獲的腎臟照片。代表性圖像展示了移植后3個月小鼠組織中腎包膜下內(nèi)分泌移植物區(qū)域的宏觀組織學（蘇木精和伊紅染色）和免疫組化。比例尺分別為1毫米和200-300微米。
d. 量化S4w0與S6w1細胞在移植后150天內(nèi)糾正小鼠高血糖的體內(nèi)效果。在多個時間點進行比較。n=13-19只小鼠。
e. 通過曲線下面積（AUC）量化，展示S4w0和S6w1細胞在移植后1-3個月內(nèi)有效的降血糖效果。n=4-19。
f-g. S4w0和S6w1移植小鼠在移植后2、3、4個月的體內(nèi)葡萄糖刺激的人類C肽分泌。所有數(shù)據(jù)以均值±標準誤（mean±sem）表示，n=6。
h-i. 量化S4w0和S6w1移植物小鼠在移植后2、3、4個月受損葡萄糖耐受的體內(nèi)功能效果。條形圖表示曲線下面積，展示葡萄糖耐受和移植物功能的潛在效果。
j. 移植后3個月成熟期，從S4w0和S6w1植入小鼠收獲的移植物組織的免疫組化。比例尺為50微米。

07 移植物來源的SC-胰島單細胞顯示內(nèi)分泌譜系優(yōu)化，轉(zhuǎn)錄成熟度與功能活性明顯提升
 
圖8. 移植后和成熟期收獲的移植物細胞特征：
a. 移植成熟和收獲的SC-胰島細胞的細胞組成、轉(zhuǎn)錄組和功能特征的實驗概覽。
b. 基于流式細胞術的移植物細胞組成的餅圖量化和展示，用于分類多種胰腺細胞群體。下方的熱圖顯示了整個移植物細胞組成的部分整體表示。n=4-7只小鼠。
c. 移植前后非靶向SC-EC細胞特征和定量的代表性流式細胞術圖。
d. SC-胰島植入移植物收獲組織與移植前S6w1胰島（3個獨立分化準備的平均值）和未分化iPSCs（3個iPSC系的平均值）相比的胰島分化和成熟基因簇的熱圖投影。右上角的顏色比例尺表示基因上調(diào)（紅色；>0）和下調(diào)（藍色；<0）。移植物評估來自n=5只小鼠。SC-胰島或iPSC數(shù)據(jù)集表示為n=3個獨立復制的平均值。
e. 火山圖展示移植后3個月內(nèi)分泌成熟的程度，與移植前S6w1細胞相比，關鍵的β細胞、α細胞和內(nèi)分泌成熟相關基因上調(diào)。
f. 移植后3個月收獲的腎臟中切除的S6w1移植物圖像。在AggreWell400TM板中重新聚集和形成偽胰島的移植物收獲的單分散細胞。重新聚集的移植物衍生的SC-胰島簇的代表性圖像。比例尺為100微米。
g. 體外葡萄糖刺激的人類C肽分泌（左側(cè)）和從一百萬移植物收獲細胞重新聚集形成胰島樣簇的總?cè)祟怌肽含量的量化。

PART 04 結(jié)論
本研究成功開發(fā)了一種生成SC-islets的全階段完全懸浮分化培養(yǎng)方案。利用垂直輪生物反應器技術使生成iPSC衍生的人類胰島效率更高。這些胰島在體外和體內(nèi)均顯示出與成人供體胰島相似的功能成熟度和轉(zhuǎn)錄組特征。垂直輪生物反應器系統(tǒng)不僅提高了胰島的產(chǎn)量和功能成熟度，還減少了細胞損失和異質(zhì)性，為未來的糖尿病細胞療法提供了有力的技術支持。

PART 05 未來展望
這項研究為糖尿病的治療提供了新的希望。未來的工作將進一步優(yōu)化這些協(xié)議，以實現(xiàn)流體動力學的改進、減少機械剪切應力，并探索去除不需要的非目標細胞群體的方法。最終，這項技術有望加速自體干細胞衍生的胰島細胞療法的開發(fā)，為所有形式的糖尿病患者提供無需抗排斥藥物的治療方案。

PBS垂直輪式生物反應器的主要特點：
✔低剪切、均勻混合的水動力學環(huán)境
✔0.1L-80L規(guī)格，滿足客戶從早研、臨床至商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模不同階段的需求 
✔實現(xiàn)真正可靠的放大性
✔GMP版本就緒

PBS反應器適用的3D懸浮培養(yǎng)場景（包含但不限于）：
➡ iPSC（以聚集體形式生長或基于微載體培養(yǎng)）
➡ iPSC-islets （iPSC分化全流程）
➡ iT/ 原代CAR-T細胞
➡ iNK /原代NK單細胞
➡ 原代 MSC/iMSC
➡ 類器官（iPSC來源神經(jīng)和心臟類器官等）
➡ 人腫瘤細胞系

上海曼博生物是PBS反應器在國內(nèi)的官方授權代理商。
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