qPCR擴(kuò)增曲線有哪些異常的現(xiàn)象和實(shí)用對(duì)策

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中，正常的擴(kuò)增曲線一般呈S型，Ct值最好在20-30之間。異常的擴(kuò)增曲線包括曲線無(wú)平臺(tái)期、曲線呈鋸齒狀和Ct值偏大等現(xiàn)象。擴(kuò)增曲線有哪些現(xiàn)象。
 
1. Ct值偏大（如Ct值＞30）
1）模板量低或基因表達(dá)豐度低，建議增加模板量觀察Ct值能否成相應(yīng)倍數(shù)減少。
2）qPCR整個(gè)反應(yīng)條件不適宜或引物設(shè)計(jì)不當(dāng)導(dǎo)致擴(kuò)增效率低，建議通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確認(rèn)擴(kuò)增效率。
3）擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)長(zhǎng)，建議用三步法程序擴(kuò)增或通過(guò)優(yōu)化引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度最好不超過(guò)300bp。
4）體系中可能存在抑制劑影響酶的活性，建議梯度稀釋模板或重新制備純度更高的模板。

2. 擴(kuò)增曲線無(wú)法達(dá)到平臺(tái)期
基因豐度低、循環(huán)數(shù)較少，建議增加循環(huán)數(shù)或選擇適合低豐度基因定量的產(chǎn)品。

3.擴(kuò)增曲線平臺(tái)期鋸齒狀
1）RNA純度低，建議梯度加大模板稀釋倍數(shù)看優(yōu)化效果或重新制備高純度RNA重新實(shí)驗(yàn)。
2）儀器長(zhǎng)時(shí)間未校準(zhǔn)，建議定期進(jìn)行儀器校準(zhǔn)保養(yǎng)。

4.有熔解曲線，無(wú)擴(kuò)增曲線
可能是擴(kuò)增程序設(shè)置錯(cuò)誤，未進(jìn)行熒光信號(hào)搜集，建議重新實(shí)驗(yàn)，增加擴(kuò)增程序中延伸階段熒光信號(hào)的搜集。

5. 陰性對(duì)照有擴(kuò)增
1）NTC有擴(kuò)增，可能有以下兩種情況：
①Ct＞35，熔解曲線Tm值＜80℃（一般正常qPCR產(chǎn)物，大小在100-300bp之間，熔解曲線Tm大多在80°C以上），可能是引物二聚體導(dǎo)致，可進(jìn)一步優(yōu)化引物。
②有Ct值且＜35，表示反應(yīng)體系被污染，可逐步排除污染源。
2）NRC有擴(kuò)增
NTC正常，NRC有Ct值，可能是RNA含有g(shù)DNA污染。建議用DNase I消化或使用含有g(shù)DNA去除的反轉(zhuǎn)錄試劑盒。
【注】NTC是指將H2O代替模板的陰性對(duì)照反應(yīng)；NRC是指將未反轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板的陰性對(duì)照反應(yīng)。

6.復(fù)孔重復(fù)性差
1）加樣誤差導(dǎo)致，建議移液器定期校準(zhǔn)，另外可通過(guò)擴(kuò)大反應(yīng)體系或提前配制好預(yù)混液優(yōu)化。
2）模板量低，建議提高模板量，使Ct值落在15-30之間。
3）儀器長(zhǎng)時(shí)間未校準(zhǔn)，建議定期進(jìn)行儀器校準(zhǔn)保養(yǎng)。